吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒（IAA比色法）
产品货号：BA
产品规格：50T
产品简介：
植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸(IAA)是植物体内普遍存在的一种生长素，内植物体内IAA的含量，对于植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。植物体内存在吲哚乙酸氧化酶(Indoleaceticacidoxida-se)，该酶是植物体内一种氧化分解吲哚乙酸的酶，吲哚乙酸氧化酶能够氧化IAA使其失去活性，从而调节体内IAA的水平，影响植物的生长。
吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)检测原理是吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下形成吲哚醛，使体系中吲哚乙酸含量减少，剩余的吲哚乙酸在无机酸存在下与FeCl3作用生成红色螯合物，吲哚乙酸氧化酶活性的大小可以用其破坏吲哚乙酸的速度表示，通过比色法(酶标仪)测定nm处吸光度，根据对照与待测样品中吲哚乙酸含量的差值，计算出吲哚乙酸氧化酶活性水平，该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中吲哚乙酸氧化酶活性，尤其适用于定量测定植物样本吲哚乙酸氧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
自备材料：
1.恒温箱或水浴锅
2.研钵或匀浆器
3.离心管或试管
4.低温离心机
5.浓硫酸
6.比色杯
7.分光光度计
操作步骤(仅供参考)：
1.准备样品：
①植物样品：将大豆或绿豆等种子置于30℃中避光萌发3~4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶和根，留下胚轴作为材料。取胚轴称重，按每mg加入1ml的预冷的IAALysisbuffer的比例，冰浴情况下充分匀浆或研磨，4℃g离心20min，留取上清液即为吲哚乙酸氧化酶粗提液。短期4℃保存待用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-4℃保存，用于吲哚乙酸氧化酶的检测。
③用细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用IAALysisbuffer进行适当匀浆，4℃g离心20min，取上清液，-4℃保存，用于吲哚乙酸氧化酶的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高活性的吲哚乙酸氧化酶，可以使用IAALysisbuffer工作液进行恰当的稀释。
2.配制IAA显色工作液：取适量的IAA显色液，按IAA显色液：蒸馏水：浓硫酸=1：4：6的比例混合，即为:IAA显色工作液，4℃密闭保存，即配即用，不易久置。注意：浓硫酸为强腐蚀性物质，操作须极其小心。
3.稀释IAA标准溶液：取适量的IAA标准(μg/ml)，按下表进行稀释：
4.样本处理：按照下表设置对照液、测定液，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。
5.IAA加样：按照下表设置空白管、对照管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡，取若干离心管或试管先加入4mlIAA显色工作液，再分别加入1ml对照液、测定液，小心混匀，置于40℃孵育30min，使反应液呈红色。如果样品中的吲哚乙酸氧化酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行管，求平均值。
6.IAA测定：比色杯光径1cm，以空白管调零，以分光光度计测定标准管、对照管、测定管nm处吸光度(记为A标准、A对照、A测定)。
计算：
吲哚乙酸氧化酶活性定义：以1ml在吲哚乙酸氧化酶提取液在1h内氧化的吲哚乙酸量(mg)表示酶活力大小。
以1~8号系列IAA标准溶液浓度(5、10、15、20、25、30、35、40μg/ml)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，直接计算直线回归方程。
组织样品的吲哚乙酸氧化酶活性(μg/ml·g·h)={(C1-C2)×V×VT}/(W×t×V1)
式中：C1=根据标准曲线求得的对照管IAA含量(μg/ml)
C2=根据标准曲线求得的测定管IAA含量(μg/ml)
VT=酶提取液稀释后总体积(ml)=步骤1结束时所得酶粗提液体积(ml)
V1=加样时所用酶的体积(ml)=0.2
V=样本处理时的液体总体积(ml)=5
W=样品鲜重(g)
t=酶反应时间(h)=1
液体样品的吲哚乙酸氧化酶活性(μg/ml·g·h)={(C1-C2)×V×VT}/(W×t×V1)
式中：C1=根据标准曲线求得的对照管IAA含量(μg/ml)
C2=根据标准曲线求得的测定管IAA含量(μg/ml)
VT=酶提取液稀释后总体积(ml)=即步骤一结束时所酶粗提液体积(ml)
V1=加样时所用酶的体积(ml)=0.2
V=样本处理时的液体总体积(ml)=5
t=酶反应时间(h)=1
注意事项：
1.实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于-20-80℃。
2.待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
3.如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑酶标仪的最大检测体积。
4.IAA标准(pg/ml)见光易分解，含有IAA的相关操作均应尽量避光操作。
5.所测样本的浓度过高，应用IAALysisbuffer工作液稀释样品后重新测定。
有效期：6个月有效。4℃运输，4℃保存。
