酶法检测乙酰胆碱和胆碱试剂盒代测 [复制链接]

一、概况

乙酰胆碱和它的生物合成前体胆碱，在人和许多动物中都存在，主要集中于神经系统、脑组织及神经肌肉组织。检测在组织上进行，一般都要加胆碱酯酶的抑制剂如毒扁豆碱，以阻止它们的进一步水解。组织样品经预处理后，可通过电泳收集用四乙基胺显示出来的乙酰胆碱和胆碱区带。乙酰胆碱在中性pH很稳定，但在酸性和碱性条件下就会水解。

二、以胆碱激酶为试剂

胆碱激酶(ATP：胆碱磷酸转移酶，EC.2.7.1.32)有两种来源：酵母和兔脑，都已制成商品，它们都可用来对胆碱和在碱水解以后的乙酰胆碱进行高度专一的检测。

啤酒酵母来源的酶作用各种底物的K值及水解相对速度如下表。可见该酶对胆碱具有较高的选择性；乙醇胺和单甲基氨基乙醇对检测没有显著影响。兔脑酶同样也是较高度专一的。

1、分光光度法

乙酰胆碱酯酶(AchE)催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在nm处有吸收峰。

2、荧光法

检测可用P-标记的ATP(NewEnglandNuclearBoston进行，形成的P-磷酰胆碱通过柱层析从反应物中分离出来后再用液体闪烁谱仪测定。

检测范围为0.01~2毫微克分子，变异系数约7.5%。可以通过两种措施来提高检测系统的专一性，即先用电泳将胆碱与乙酰胆碱和组织中的其它物质分开，然后再通过柱层析将标记的磷酰胆碱分离出来。

有文献介绍了一种能直接用于脑抽提液中胆碱和乙酰胆碱检测的荧光光度检测法：

其中，PK为丙酮酸激酶(ATP：丙酮酸-2-邻-磷酸转移酶，EC.2.7.1.40)，LDH为乳酸脱氢酶(L-乳酸：NAD氧化还原酶，E.C.1.1.1.27)。

游离的胆碱可根据反应首先进行测定，即检测NADH在激发=nm(Hg)以及入射=~nm的荧光，结果表明，胆碱量在1~微克分子范围内，校正线是线性的。乙酰胆碱然后可通过乙酰胆碱酯酶(乙酰胆碱水解酶E.C.3.1.1.7)将其水解后进行测定。这样测定的结果是总的胆碱加乙酰胆碱。

三、用乙酰CoA合成酶检测

通过下述偶联的酶反应以荧光法测定了乙酰胆碱/p>

其中用到的酶是:乙酰CoA合成酶(EC，MDH(苹果酸脱氢酶，E.C.1.1.1.37)和CS(柠檬酸缩合酶，E.C.4.1.3.7)。然后跟踪NADH荧光的变化。乙酰CoA合成酶是速度限制因素。对含有10-~10克分子的脑样品进行测定，重复性为5%。此法也能用来检测乙酸和乙酰-S-CoA，重复性十分好。

四、用醇脱氢酶检测乙酰胆碱

发展了一种乙酰胆碱的直接检测法，用硼氢化钠将乙酰胆碱还原为乙醇/p>

ADH为醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)，产生的NADH可在入发=nm(Hg)和入发射=nm以荧光光度法测定。血液中原有的乙醇产生干扰,应先加以检测。