治疗白癜风哪里好 http://www.weidumeiye.com/m/柠檬酸合酶（CS）活性检测试剂盒（可见分光光度法）
产品货号：BA
产品规格：10管/5样、25管/12样、50管/24样
产品简介：
CS（EC2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在nm处有特征吸光值。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
溶液的配制：
1.试剂五：临用前加入μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2.试剂六：临用前加入1.5mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1)称取约0.1g组织或收集万细胞，加入1mL提取液和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2)将匀浆液g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，g，4℃离心10min。
3)上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS。
4)在沉淀中加入μL试剂一和2μL试剂二，反复吹打充分混匀，用于CS测定，并用于蛋白浓度测定。
二、测定步骤
1.分光光度计预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。
2.试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。
3.操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入
将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，记录nm波长下10秒时的初始吸光度A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，nm下记录2分10秒时的吸光度A2，并计算测定管的ΔA1=A2-A1，对照管的ΔA1’=A2-A1，ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三、CS活性计算
按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：37℃或25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmolTNB定义为一个酶活力单位。CS（U/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（Cpr×V样本）÷T=×ΔA÷Cpr
ε：TNB的消光系数，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，1mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。
注意事项：
1.测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5.附：使用样本鲜重计算公式
单位的定义：37℃或25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmolTNB定义为一个酶活力单位。
CS上清（U/g质量）=ΔA上清÷ε÷d×V反总÷（W×V样本÷V提取）÷T=×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g质量）=ΔA沉淀÷ε÷d×V反总÷（W×V样本÷V样总）÷T=×ΔA沉淀÷W
CS（U/g质量）=CS上清+CS沉淀=×ΔA上清÷W+×ΔA测定÷W
ΔA上清：上清测定值；ΔA沉淀：沉淀测定值；ε：TNB的消光系数，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，1mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.mL；V提取：提取液体积，1.01mL；V样总：溶解沉淀的总体积，0.mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g。
