液相色谱中目标分析物不稳定原因浅析 [复制链接]

摘要一个稳健的分析方法是一个分析人员乐于见到的，它能给分析人员省去很多麻烦。但实际情况是，我们会经常遇到各种各样的“不稳定”，导致数据的可靠性大打折扣。基于此，笔者将结合自身的工作经验来对液相色谱中目标分析物“不稳定”原因进行浅析。01溶解性导致的“不稳定”溶解性是指化合物在一种特定溶剂中溶解能力大小的一种属性，是指一种物质能够被溶解的程度。在液相色谱分析方法中，为避免强溶剂体系引起溶剂效应，分析人员经常会优选与流动相起始有机相比例接近的溶剂体系进行化合物的溶解。对于水溶性化合物，该做法不存在问题，但当遇到水溶性差的化合物时，即使在该溶剂强度下，目测样品已溶解，但其可能并非真正意义上的溶解。一般情况下，温度的降低不利于样品的溶解，基于此，为考察样品是否真正溶解，可以配制目标浓度样品溶液，在较为苛刻的冷藏条件下过夜或者采用更长的时间来考察。如在分析如下化合物时：笔者采用乙腈-水（30:70）作为稀释剂，发现在连续进样过程中，化合物的峰面积呈现逐渐减小的趋势，且在谱图中并未发现其他降解峰产生。通过观察进样小瓶，发现瓶中已有絮状沉淀产生，故此可以推断，该化合物的“不稳定”极大可能源于样品本身较差的水溶性。增加稀释剂中的有机相的比例至60%，该异常问题得以解决。基于上述案例可知，当遇到因较差水溶性而导致的样品“不稳定”，可以通过增加有机相的比例来解决这一类问题。但这一解决措施并不是万能的，尤其是要兼顾其他较强极性化合物的分析时。不加思考的增加溶剂中有机相的比例，极易导致较强极性的化合物因溶剂效应而产生峰畸变。基于此，我们针对水溶性差的化合物，还可以采取成盐的方式来增加其水溶性，从而避免分析过程中溶剂效应的发生。例如在分析如下化合物时：笔者采用乙腈-水（60:40）作为稀释剂进行分析。虽然该化合物（ImpD）峰型以及稳定性均良好，但另一极性较强的化合物（ImpB）峰明显畸变。但当笔者采用乙腈-水-甲酸（30:70:0.1）作为稀释剂时，该化合物与甲酸成盐，结构如下所示。在该溶剂中，ImpD水溶性极大增加，且化合物ImpD以及较强极性化合物ImpB的峰型、稳定性均良好。具体如图1所示。图1不同稀释剂条件下ImpB及ImpD峰型对比该案例表明，当碱性化合物水溶性差时，可以在稀释剂中添加适量有机酸或无机酸来增加其溶解性；当酸性化合物水溶性差时，可以在稀释剂中添加适量的有机碱或无极碱来增加其溶解性，以此来规避该类化合物的“不稳定”，并做到同时维持分析系统中（较）强极性化合的优异峰型。02吸附导致的“不稳定”该类“不稳定”常常会发生在分析碱性化合物的时候。比如笔者在以乙腈-水（200）作为稀释剂分析如下含肼结构结构的化合物时：发现在连续进样过程中，含肼结构化合物ImpA的峰面积呈现逐渐减小的趋势，峰面积RSD(n=5)=6.13%，且在谱图中并未发现其他降解峰产生，如图2所示。通过调查发现该“不稳定”并非溶解性差所致。初步推测玻璃材质的进样小瓶内表面“酸”属性的硅醇基导致了该带有联胺（肼）结构的强碱性化合物的吸附，从而导致了该化合物的“不稳定”。为论证这一猜想，笔者在稀释剂中加入了能够竞争性吸附的磷酸根离子进行考察。考察结果表明当以mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈（80:20）为稀释剂时，化合物的峰面积几乎无减小趋势，峰面积RSD(n=5)=1.24%，该“不稳定”现象消失，如图3所示。图2乙腈-水（200）作为稀释剂时的叠图图3mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈（200）作为稀释剂时的叠图03特征官能团“敏感性”导致的“不稳定”该类“不稳定”通常是因为化合物中具有对酸、碱、湿、氧、温度、光照、金属等敏感的官能团或结构存在。比如说，当目标分析物中存在内酰胺结构时，稀释剂及流动相中的酸碱需慎用；当目标分析物中存在喹啉羧酸结构以及酚羟基结构时，样品储存及配制过程中需避光，等等。例如笔者曾经历过这样一个案例。含缩酮结构化合物结构如下所示：当尝试以水-乙腈（80:20）作为稀释剂、50mmol/L乙酸铵（pH4.7）缓冲溶液-乙腈（95:5）作为A相、乙腈作为B相时，连续进样7次，ImpA峰面积呈现明显的增加趋势，其峰面积RSD值为47%。通过观察化合物结构，推测在稀释剂中硫酸游离出氢离子，随后氢离子进攻缩酮生成ImpA。其内在机理可能如下所示：为论证这一猜想，笔者将稀释剂更换为50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈（80:20），流动相维持不变，在同一色谱条件下进行考察，连续进样5次，ImpA峰面积几乎无变化趋势，对应峰面积RSD值为0.7%。具体图谱如下所示。当以水-乙腈（80:20）作为稀释剂时，供试品溶液的pH为2.27；当以50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈（80:20）作为稀释剂时，供试品溶液的pH为7.12。这也为氢离子进攻缩酮，从而生成impA的猜想提供了依据。图4通过抑制氢离子作用考察ImpA稳定性以上，笔者通过溶解性、吸附、敏感性的角度阐明了液相色谱中样品溶液不稳定的可能原因，以上案例均为笔者经验之谈，若有纰漏之处，望同行指正。

声明：本文转载来源于