6.样品用微量离心机以最大转速于4C离心1lmin。将上清移入另一新的离心管中,应特别小心,不要将聚丙烯酰胺凝胶块转移进去(使用一根拉长的巴斯德吸管效果甚佳)。
7.向聚丙烯酰胺沉淀物中再加入0.5倍体积丙烯酰胺凝胶洗脱缓冲液。振荡片刻再次离心。合并两次上清液。
8.(可选做),上清液通过一次性使用的塑料层析柱(如IsoLabQuick-Sep柱)或装有WhatmanGF1C滤膜或充填硅化玻璃棉的注射器针简,以除去残留的聚丙烯酰胺凝胶块。
洗脱的DNA可用酚:氯伤和氯仿抽提以去除sDs,SDS能阻断对DNA的后续酶促反应。然后按步骤9的方法用乙醇沉淀提取到的DNA并进行后续步骤。
9.将2倍体积的4C预冷乙醇加到滤过液中,冰上放置30min。在微量离心机中以最大转速于4C离心10min,回收DNA.可能由于洗脱液中存在少量聚丙烯酰胺,甚至很少量的DNA亦可被乙醇有效沉淀GaillardandStrauss)。
而在沉淀前加入10μgtRNA(商业有售)可进一步提高小量DNA的回收率。必须确知RNA的存在不会干扰DNA的后续反应,方可加入RNA。
10.用uLTE(pH8.0)溶解DNA,再加入25μL3mo/L乙酸钠溶液(pH5.2),然后按步骤9的方法用2倍体积的乙醇再次沉淀DNA。
11.用70%乙醇小心洗涤DNA沉淀。采用TE(pH8.0)溶液溶解DNA至终体积10μL。