具中科博生研究表明,微载体上消化细胞的分离有以下几个步骤:
(1)分沉降
利用細胞和徹载体的沉降速率不同而分离细胞.当细胞从微载体上消化下来以后,让微载体沉淀,细胞在上清中。中科博生。
(2)过滤
为获得较高的细胞回收率,可用过濾的方法。对动物细胞无毒性的任何滤器都适合,过滤时选择孔径μm左右的滤器。中科博生。
(3)密度梯度离心
细胞和微载体存在密度差异时,可釆用密度梯度离心从微载体细胞混合物中分离细胞。中科博生。
优良的微载体应具有以下特性:
①不含对细胞有毒的成分,与细胞有良好的相容性;
②密度在1.03l.05g/ml之间,溶胀后微粒直径在μm左右;
③能在PBS中耐受min的高温(C)、高压蒸汽灭菌;
④基质为非刚性材料避免培养过程中因为载体的相互碰撞损伤细胞;
⑤不吸收培养基中的营养物质及目的产物;
⑥价格低廉能重复使用。中科博生。
以下以Cytodex1微载体为例,介绍微载体培养的一般操作步骤:
①选用2%5%乙酸乙酯的甲基硅油硅化处理的搅拌瓶,室温下自然晾干后,用去离子水反复冲洗,常规高压蒸汽处理20min。
②称取适量的Cytodex1,室温下用50~mlPBS浸泡4h以上,必要时加入适量的吐温80,使之充分膨胀,再用PBS漂洗23遍,。C、l.lkgf/cm2高压蒸汽处理15min。
③吸去经高压蒸汽处理的微载体中的PBS,用培养基浸泡微载体24h。
④吸去用于漂洗微载体的培养基,加入适量含血清的培养基。
⑤用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞,用培养基悬浮分散充分的细胞。
⑥将细胞以一定的密度接种入搅拌瓶中,将搅拌瓶移入37C的温箱中,放至搅拌装置上,细胞接种后最初46h,采用缓慢搅拌或间歇搅拌,尽可能使细胞均匀悬浮在微载体上。
⑦调节搅拌速度至r/min,使微载体充分悬浮并有利于气体的传递并不损伤细胞,观测细胞生长情况,检测并控制细胞生长环境的变化。
中科博生期待大家一起探讨学习。