凝胶中蛋白的可视化
在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜效率；不需要转膜，只需观察SDS-PAGE结果。
考马斯染色
切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散（溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用40%蒸馏水、10%醋酸、50%甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。
为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比0.25%的考马斯亮蓝R-，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育4小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到67.5%蒸馏水、7.5%醋酸、25%甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。
染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。
铜染色法
用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多30分钟），然后转移至0.3MCuCl2溶液染色5–15分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用0.1–0.25MTris/0.25MEDTApH8.0重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。
转膜
转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。
转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。
在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。
湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是1xTris-甘氨酸缓冲液，但是没有SDS，并加入了甲醇至终浓度20%。对于分子量大于kDa的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为0.1%的SDS。
在半干法转膜中，三明治由滤纸凝胶膜滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。
半干转的转膜缓冲液中Tris和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是48mMTris、39mM甘氨酸、0.04%SDS、20%甲醇。
有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡1–2分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育5分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。
小分子和大分子蛋白的转膜
转膜缓冲液中SDS和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：
大分子蛋白(kD)
对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。
大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。
降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。选择湿转4°C过夜，不建议选择半干转。小分子蛋白(kD)
SDS妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加SDS。
保持甲醇的浓度20%。
对于kD的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：
BoltMWandMahoneyPA().High-efficiencyblottingofproteinsofdiversesizesfollowingsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis.AnalBiochem,,–92.
更多转膜提示：
使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。
将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者15mL管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。鸡来源的抗体会结合在PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以帮助降低背景染色。丽春红染色使膜上蛋白可视化
要确定转膜的成功，用TBST洗膜。将丽春红母液按照1:稀释。母液是2%的丽春红S加入30%的三氯乙酸和30%的磺基水杨酸制成。
在丽春红染色液中孵育5分钟，然后用大量水冲洗直至水清澈、蛋白条带显现。该膜可以用TBST或水重复冲洗至完全脱色。对于PVDF膜，用甲醇重新激活后，再用TBST清洗。
TBS10x
1L溶液；24.23gTrizmaHCl80.06gNaCl在mL蒸馏水中溶解用HCl将pH调至7.6将体积加至1L
TBST
Tween20很黏稠，会粘在枪头上。请确保在Tris缓冲液中加入正确的剂量。使用10%的溶液比直接加入未稀释的Tween20更容易操作。
膜的封闭
封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。
通常使用两种封闭溶液：脱脂牛奶或BSA(CohnfractionV)。牛奶相对便宜，但是不推荐用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，可能会导致抗体的非特异性结合，形成高背景。
有些抗体对BSA封闭的膜比牛奶封闭的膜信号更强，原因还不清楚。查看数据表中的应用说明，看其中是否有封闭的具体说明。
配置5%的牛奶或BSA溶液，即在每mLTBS含Tween20(TBST)的缓冲液中加入5g牛奶或BSA。充分混合并过滤。不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。
在摇床上4°C孵育1小时。孵育后用TBST冲洗5秒。
一抗孵育
孵育缓冲液
以建议稀释度在TBST中稀释抗体。如果数据表没有标明建议稀释度，设计稀释梯度(1:–1:)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异性条带。
某些实验室习惯使用封闭缓冲液，而另一些实验室则使用不含封闭剂的TBST来孵育抗体。您可能会发现抗体缓冲液加或不加封闭剂，不同的抗体，结果也不尽相同，。
如果没有高背景问题，用低浓度(0.5–0.25%)甚至完全不加牛奶或BSA，有些抗体会产生更强的信号。
孵育时间
时间可能从几小时到过夜不等（不超过18小时），取决于抗体对蛋白的亲和力和蛋白丰度。我们建议抗体更高的稀释度、更长的孵育时间，确保特异性结合。
孵育温度
最好低温孵育。如果在封闭缓冲液中孵育过夜，必须在4°C孵育，否则会出现污染从而破坏蛋白（尤其是磷酸化基团）。
建议在摇床上孵育，充分均匀覆盖膜，防止结合的不均匀。
二抗孵育
用TBST清洗膜数次，每次清洗5分钟或更长，去除残余一抗。
孵育缓冲液与稀释度
以建议的稀释度在TBST中稀释抗体。如果数据表没有推荐的稀释度，设计稀释梯度(1:1,–1:2,0)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异条带。您可以在封闭缓冲液中孵育二抗，但是在降低背景时可能会牺牲特异性信号的强度，这可能是因为封闭蛋白会阻碍抗体目标蛋白的结合。
孵育时间和温度
摇床上室温孵育1–2小时。
选择哪个偶联物？
我们推荐辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗，不推荐碱性磷酸酶(ALP)偶联的二抗，因为其灵敏度较低。
显影方法
检测试剂盒
对于HRP偶联的抗体，通常使用加强的化学发光(ECL)试剂盒作为底物。我们提供不同检测灵敏度的HRP底物。
X射线胶片
自动化X射线胶片仪，简单易用，被广泛使用。切记，过曝的胶片不适合进行分析，因为无法确定蛋白的相对量。且过曝的胶片会显现全黑条带，没有对比，有大量非特异性条带。
数码拍照
新一代显影仪内含摄像头，无需暗室。摄像头检测到膜上的化学发光，将信号转换为数码照片，并利用仪器提供的软件进行快速分析。
现在市场上有一系列机器可以选用。处于下一代前沿的是不使用HRP偶联抗体（即化学发光）的系统。举个例子，STORM分析仪检测来自荧光偶联二抗的荧光。Odyssey红外成像系统检测红外荧光。
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