在免疫组织化学中最常见的问题是背景的产生影响对实验结果的解释。常见的产生背景染色原因有哪些呢？这篇文章会讲述最常见的2类原因：内源性酶活性和其他内源性物质活性。
内源性酶活性
1、内源性过氧化物酶活性
内源性过氧化物酶活性天然存在于红细胞（假过氧化物酶)、粒细胞（髓过氧化物酶)及神经元中的酶，可与DAB反应产生棕色产物，而这种产物难以与特异性的免疫染色区别。用H水稀释液(0.03%～3%)(含0.1%叠氮钠）预处理可以减少或消除冷冻切片红细胞的假过氧化物酶活性及髓样细胞过氧化物酶活性。常规石蜡包埋组织切片以及出血较多或含酸性高铁血红素切片需要浓度更高的H2O2(3%H2O2水溶液及0.1%叠氮钠)或者在稍低浓度溶液中延长孵育时间来消除内源性酶活性。H2O2-甲醇不推荐常规使用,尤其是检测细胞表面抗原时。
甲醇对抗原性及免疫反应性有不良影响,应避免使用。但是,如果必须使用H2O2-甲醇时,应将孵育时间控制在15min之内。
2、内源性碱性磷酸酶
哺乳动物组织的碱性磷酸酶有两种同工酶,在使用碱性磷酸酶方法时会产生背景染色:肠源型和非肠源型两种形式。1mmol/L左旋咪唑就可抑制非肠源型的碱性磷酸酶同工酶，而牛肠型碱性磷酸酶同工酶在碱性磷酸酶免疫染色方法中作为报告分子使用而不受影响。1%乙酸可阻断该同工酶,但同时也会破坏一些抗原。
其他内源性物质活性
1、内源性亲和素/生物素活性
内源性生物素广泛分布于哺乳动物组织,尤其在肝脏、肺、脾、脂肪组织、肾脏、脑等组织中含量丰富。组织经福尔马林固定后,内源性生物素产生的背景会大大降低,但在冷冻切片中其产生的背景会增强。碱性卵白亲和素的高离子强度对带相反电荷的细胞分子,如核酸、磷脂类、肥大细胞胞质中的葡萄糖氨基聚糖类等具有较高吸附能力,产生非特异性的结合。卵白亲和素等电点为10,在免疫染色的pH接近中性缓冲液中为碱性,带正电荷。剧烈的热抗原修复法会将经福尔马林固定组织中的内源性生物素暴露,而检测系统中的亲和素可与其结合产生强烈背景,需要对其进行抑制,用pH9.4代替pH7.6的生物素标记溶液制备链亲和素生物素复合体（ABC）可以防止这种非免疫的结合。另外,5%脱脂奶粉溶液可以抑制亲和素-荧光素结合物对细胞核、细胞质、细胞膜的非特异性吸附。用链亲和素(来源于Streptomycesavidinii,等电点为5.5～6.5)替代卵清中的亲和素可显著降低免疫组化中的非特异性吸附,市售商业试剂盒中应用较为普遍的亲和素类型就是链亲和素,有一种市售的含0.1%链亲和素及0.01%生物素的试剂可以封闭这种内源性活性。有些基于酪胺-链亲和素的高敏感检测系统需要预先封闭,以避免产生过度背景。作为替代方法,目前已有商品化的基于多聚核酸的检测系统也已经上市,可以避免使用标记亲和素的二抗和亲和素-生物素阻断试剂。
2、内源性免疫球蛋白活性
免疫组织化学法中,一抗与组织表面的免疫球蛋白结合就会产生背景。在孵育一抗前应使用非特异阻断试剂,如5%牛血清白蛋白可以封闭一抗与组织中非特异抗原的结合。
菲恩生物IHC结果展示
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