一、概况
在组织、细菌和病毒中存在着一些具有重要生物学意义的胺类物质。这里仅讨论其中三种:组胺、精胺和精脒,存在于血清中的其它胺类物质如脲、谷氨酰胺和肌酸等。
组胺,是一种有机含氮化合物,是由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的。许多组织,特别是皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏反应时,都可释放组胺。组胺有强烈的舒血管作用,并能使毛细血管和微静脉的管壁通透性增加,血浆漏入组织,导致局部组织水肿。
精胺是含有两个氨基和两个亚氨基的多胺类物质,在生物体内由腐胺(丁二胺)和S-腺苷蛋氨酸经多种酶催化后生成。它与亚精胺都存在于细菌和大多数动物细胞中,是促进细胞增殖的重要物质。在酸性条件下,它呈现出多阳离子多胺类特性,并能与病毒与细菌中DNA结合。使DNA分子具有更大的稳定性与柔韧性,也是细胞培养液中必要组分之一。
精脒又称亚精胺,又称三盐酸亚精胺,是一种多胺。广泛分布在生物体内,是由腐胺(丁二胺)和腺苷甲硫氨酸生物合成的。亚精胺可抑制神经元合成酶,结合并沉淀DNA;也可用于纯化DNA结合蛋白,刺激T4聚核苷酸激酶活性。年9月1日,德国和奥地利的科学家合作研究表示,亚精胺或可阻止老年痴呆症发病。
为了检测上述几种胺要用到两种一般性的酶,二胺氧化酶和单胺氧化酶。
二、二胺氧化酶测定胺
二胺氧化酶(E.C.1.4.3.6)存在于狗肾、猫肾、豚鼠肝、兔肝、人胎盘、牛和猪的血浆、豌豆以及耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmates)中,能催化胺类物质脱氨变成氨和过氧化氢。。
狗肾来源的酶能作用各种烷基胺和芳香胺,如苄胺、酪胺、墨斯卡灵和组胺;由于此酶对组胺具有活性,故也常称为组胺酶,可用于组胺的检测。它催化单胺物质脱氨时,需要用高浓度的底物和大量的酶;作用二胺类的Km大约是相应单胺物质的1/10。
对于烷基胺化合物来说,为了易于降解,其氨基间必需有4~5(n=4或5)个碳原子的短链隔开。
一般地说,第一氨基通常是不能取代的,而第二氨基可以单取代也可双取代(R或R可以是CH或H)。
含氮的芳香族系统可以代替第二个氨基,例如咪唑、吡唑以及1,2,3-三唑的氨基乙基衍生物都是好的底物,但是2-和4-(2-氨基乙基)吡啶却不能作为底物。
用二胺氧化酶进行胺类物质检测的方法有以下几种:
(1)用比色法或荧光法检测未反应的胺;
(2)用测压法检测氧的消耗;
(3)直接检测形成的醛(因为由苯甲胺形成的苯甲醛nm有最大吸收值,即入最大=nm),或者通过转变为Δ1-二氢吡咯衍生物最大~nm)检测形成的醛;
(4)以测压法检测游离的氨;
(5)用类似以前讨论的过氧物酶-染料反应系统检测形成的过氧化氢。
根据这些方法之一,有文献应用检测胺类的邻苯二醛荧光光度法,通过测定组胺的消失建立了一种高度灵敏的二胺氧化酶分析法。它能检出非常低的浓度,并可用于组胺的检测。
有文献中采用贝克曼(Beckman)离子选择性电极进行了胺类的分析。这种电极能感应形成的铵离子,线性范围为10-1~10-5克分子浓度。由于铵离子的产生,使电位随时间而发生变化,其变化的速度和胺的浓度(1~微克/毫升)成比例。
三、单胺氧化酶测定胺
单胺氧化酶(单胺:氧氧化还原酶(脱氨),E.C.1.4.3.4)在动物体内的功能是分解那些在生物学上具有重要作用的胺类物质。许多天然存在的胺类和具有药理作用的胺类都是它在体内的底物。同样,单胺氧化酶在体外也能用于胺类的测定。
单胺氧化酶能很快地作用伯胺和仲胺,但是只有甲基被取代的胺可作为底物。有些叔胺可被某些来源(如猫)的酶迅速氧化,但是用其它来源(如兔)的酶则很慢。此酶和甲胺不反应,和乙胺反应慢,作用戊胺或已胺的速度最大(在同系物CH(CHNH中,n=4~5)。与二胺氧化酶相反,它不能作用腐胺(丁二胺)与尸胺(1,5-戊二胺)。
单胺氧化酶的天然底物大多是环胺,如苯乙胺、色胺、组胺、多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和酪胺。
上述用于检测二胺氧化酶底物的方法同样可用于单胺氧化酶底物的检测。
有文献建立了一种可用以测定苄胺、糠胺、酪胺、组胺以及其它胺类的荧光方法。即将单胺氧化酶反应产生的过氧化物用过氧物酶和对-羟苯乙酸检测。
产生的H2O再通过下述指示反应鉴定:
氧化型对-羟苯乙酸(I)的形成导致荧光产生,荧光升高的速度与苄胺或组胺的浓度成正比。
还可以采用单胺氧化酶催化单胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成有色物质,在nm处有特征吸收峰。
四、用单胺氧化酶(MAO)检测精胺和精脒
有文献应用MAO催化的氧化反应检测了精胺和精脒。由于氧化结果形成了亚胺醛,利用这种产物能和N-甲基-2-苯并噻唑酮肼反应产生在nm具有光吸收的衍生物的特点来进行测定。对于上述多胺来说,测定范围为0.01~0.1微克分子,变异系数为1.2%。
如果样品中同时存在精胺和精脒,则精脒须需分别检测,再通过差减法确定精胺。
五、用粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)来源的精胺氧化酶检测精脒
已经分离到二种不同的精胺氧化酶[精胺:氧氧化还原酶(分解供体,E.C.1.5.3.3],其一来自奈氏球菌(Neisseriaperflava)6],它具有高度的专一性,但和精胺精脒都能反应,故不能区别这两种分子;另一来自粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens),它也非常专一,而且对精脒的活性要比对精胺大倍。遗憾的是,此酶没有商品供应,不过可按已发表的方法进行分离纯化。
根据下述反应可用分光光度法测定精脒:
在37℃保温60分钟后记录nm吸光率。精脒的浓度(微克分子精脒/毫升)等于吸光率变化值/[1.85x样品体积(毫升)]。
此法对精脒十分专一,3,3-二氨基二丙基胺是唯一可氧化的另一种胺,但是由于它不产生Δ1-二氢吡咯,因此不会干扰测定。