吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA
产品规格：管/48样
产品简介：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。
IAA在无机酸条件下与FeCl3作用生成红色产物，在nm下有最大吸收峰。酶活力的大小可用破坏IAA的速率表示。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成：
溶液的配制：
1.试剂一：临用前加入5mL蒸馏水备用，4℃保存两周。
2.试剂二：临用前取1瓶加入3mL蒸馏水备用，4℃保存一周（1瓶粉剂溶解后可做T，为了延长使用时间，此产品多给1瓶粉剂）。
3.试剂三：临用前加入5.71mL50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解备用。可以-20℃分装保存两周，避免反复冻融。
4.试剂五：临用前加入15mL试剂四溶解备用，2-8℃保存两周。
5.标准品：10mg吲哚乙酸。临用前加入1.14mL50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解制成50μmol/mL的标准溶液，-20℃分装保存两周，避免反复冻融。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可参考文献）
1.组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。g4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2.细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率W，超声3s，间隔10s，重复30次）。g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1.可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至nm，分光光度计蒸馏水调零。
2.标准液的稀释：将标准溶液用蒸馏水稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.、0.μmol/mL的标准液。
3.标准液稀释可参考下表：
备注：实验中每个标准管需80μL标准溶液。
4.加样表：
三、吲哚乙酸氧化酶酶活计算
1.标准曲线的绘制：
以标准液的浓度（μmol/mL）为x轴，对应的ΔA标准为y轴绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程中计算得到样本浓度（x，μmol/mL）。
2.吲哚乙酸氧化酶活力计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmolIAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶酶活（U/mgprot）=x×V酶促×0÷(V样×Cpr)÷T=×x÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmolIAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶酶活（U/g质量）=x×V酶促×0÷(W÷V提取×V样)÷T=×x÷W
（3）按细胞或细菌数量计算：
单位的定义：每个细胞或细菌在反应体系中每分钟消耗1nmolIAA的酶量定义为一个酶活性单位。
IAA氧化酶酶活（U/cell）=x×V酶促×0÷(÷V提取×V样)÷T=0.×x
V酶促：酶促反应总体积，0.08mL；0：单位换算系数，1μmol=0nmol；V样：加入的样本体积，0.mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；：万个细胞；T：反应时间，30min。
注意事项：
1.当ΔA大于0.4或者A对照管大于1时，建议将样本用提取液稀释后进行测定；ΔA过小时，可增加酶促反应时间（1h或2h）或增加加入的样本体积来测定。注意同步修改计算公式。
2.试剂一溶解变黑后则不能使用；试剂二有毒性，做好防护措施。
实验实例：
1.取0.1g红豆加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定=A对照-A测定=0.-0.=0.，带入标曲y=2.x-0.，得出x=0.，按样本质量计算酶活得：
IAA酶活（U/g质量）=×x÷W=×0.÷0.1=.22U/g质量。